2021年，經濟合作與發展組織（OECD）正式發布了一項具有裏（lǐ）程碑（bēi）意義的測試（shì）指南——第497號（TG 497），首次將一套完整的（de）綜合（hé）體外測試方案納入國（guó）際毒理學評價體係，該方（fāng）案用於化學品的皮膚致敏性評估（gū），被視為可完全替代動物實驗。緊接著，OECD於2022年又發布了（le）另（lìng）一項綜合體外測試方案TG 467，用於評估眼部腐蝕與刺激。盡管目前僅有這兩項（xiàng）指南作為完全替代相應動物實驗的方案被納入官方毒（dú）理測試評價（jià）體係，但它（tā）們的推出仍標誌著在部分領域，非動物方法已由“輔助性工具”躍升為決策層麵的主導手段，實現了特定毒（dú）理終點（diǎn）的完全替代。但正如TG 497的成功案例所揭示的（de）那樣，實現“完全替代”的道路並非坦途——每一個被采納的替代方（fāng）案都需要在對生物機製深（shēn）入理解的基礎上，實現方法的標準化、完成多中（zhōng）心驗證及確保替代方案與人體真實反應的高度（dù）一致性。因此，目前替（tì）代成功更多是個（gè）別突破而非普遍現象。在了（le）解（jiě）TG 497前，先簡要（yào）了解下皮膚致（zhì）敏的過程和機理：化合物引發皮膚致敏反應主要涉及三個連續的生物學過程。

首（shǒu）先，多數低分子質量（通常小於500道爾頓）的化學物質本身不能被免疫係統直接識別，因此它（tā）們需首先與（yǔ）皮（pí）膚中的蛋白（bái）質發生共價結合，形成所謂的半抗原複合物（wù）。這種修飾後的（de）蛋白質結構被免疫係統識別（bié）為“外來”，成為真正具有免疫原（yuán）性的（de）抗原，進而觸發遲發型（IV型）變態反應，即皮膚（fū）致敏反應（yīng）的（de）起（qǐ）點；

第二步（bù）是角質形成細胞的應激激（jī）活。在（zài）接觸化學物質後，表皮中（zhōng）的角質形成細胞會被刺激而激活，釋放一係列促炎因子，如各種白細（xì）胞介素和胸腺基質淋巴細胞生成素等。這些細胞因子的釋放不（bú）僅增強（qiáng）局部炎症反應，還具有重（chóng）要的免疫信號功能，可吸（xī）引（yǐn）並激活樹突（tū）狀細胞（bāo）及朗格漢斯細胞向接觸部位遷（qiān）移；

第三步是樹突狀細（xì）胞的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接觸刺激部位攝取（qǔ）半抗原複合物後，成熟並遷移至區域性淋巴結，在那裏與（yǔ）T細胞相互作用，完成抗原提呈，最終形（xíng）成免疫記憶。該（gāi）免疫記憶使得個體在後續暴露相（xiàng）同化學物質時迅速出現過敏反應，表現為典型的過敏性接觸性皮炎。

從皮膚首次接觸某種（zhǒng）化學物質（zhì），到反複暴露後誘發過（guò）敏性接（jiē）觸性皮炎的（de）全過程，在現（xiàn）代毒理學中被（bèi）統稱為“有害結局通路”。該通路由多個生物學過程構成，其中的關鍵環節被稱（chēng）為“關鍵（jiàn）事件”。由上文可知，皮膚致敏的有害（hài）結局通路包含三個關鍵事件，即（1）半抗原形成；（2）角質形成細胞的激活和（3）樹突狀細胞激活。在所有已知的“有害結局通路”中，皮（pí）膚致敏性“有害結局通路”是建立（lì）最早、機（jī）製最明確，且相對容易進行體外模擬的（de）免疫反應，因（yīn）此成為了替（tì）代方法開發的突破口。

在傳統毒理學評估中，皮膚致敏性通常依賴動物整體（tǐ）反應模型（xíng）進行判斷，代表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致敏試驗，用於綜合評估致敏起始階段與（yǔ）激發階段的反應；（2）局部淋巴結試驗，聚焦於皮膚致敏（mǐn）階段。以局部淋巴結試驗為例，一次標準實驗需消耗至少20隻小鼠。據統（tǒng）計，截至2018年，僅在歐盟REACH製度實（shí）施框架下就（jiù）已有超過33,000隻小鼠（shǔ）被用於皮膚致敏性測試。

那麽TG 497中所列的動物替代技術是（shì）如（rú）何實（shí）現的呢？TG 497 所采用的“三（sān）選二策略”是基於皮膚致敏性有害結局通路中的前三個關鍵事件所構建的一種綜合性評估方（fāng）法，旨在判定（dìng）受試化學物是（shì）否（fǒu）具有皮膚致敏潛力。

首先，直接肽反應（yīng）實驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第（dì）一關鍵事件（jiàn），即被測物是否具有與蛋白（bái）質共價結合形成半抗原的能力。該（gāi）方法采用合（hé）成的含半胱氨酸或賴（lài）氨酸殘基的肽（tài）段作為模型受體，與被測物共同孵育後，通過測量肽的消耗率評估其反應性。反應結（jié）束後，利用高（gāo）效（xiào）液相（xiàng）色譜對肽段殘留量（liàng）進行定量分析。若（ruò）肽的（de）消耗顯著，說明化學物能與肽發生（shēng）共價反應，具備（bèi）潛在致敏性，從而完成對半抗原形成關鍵事件的評價。

其次，角質形成細胞激活試驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用（yòng）於評估第（dì）二（èr）關鍵事件——角質形成細胞（bāo）的氧化（huà）應激與促炎反應激活，該事件在有害結局通路中處於（yú）信號放大的早期階段。KeratinoSens™方法基於轉基因人永生化角質形成細胞係HaCaT，該細胞穩定表（biǎo）達一個由抗氧（yǎng）化反應元件驅動的熒光素酶報（bào）告基因。當潛在致敏物質刺激角質形（xíng）成細胞時，會引發細胞內應激響應，從而啟動熒光（guāng）素酶表達。通過測定熒光素酶活性，即可定量評估化學物對該通路的激活能力，進而判（pàn）斷其是否誘導（dǎo）角（jiǎo）質形成細胞釋放促炎因子。

最後，人源（yuán）樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬（nǐ）有害結局通路中的第三關鍵事件——樹突狀細胞的激活。在致敏過程中，被測物通過局部（bù）炎症信號激活樹突狀細胞，後者在抗原識別、處理及向T細胞提呈（chéng）抗原的過程中起到橋梁作用。h-CLAT方法使用人急性單核細胞白血病細胞係THP-1作為（wéi）樹突狀細胞的替代模型。當致敏化學物作用於THP-1細胞後，若具免疫（yì）激活能力（lì），將（jiāng）誘導其表麵（miàn）共刺激分子（如CD86和CD54）表達上調。通過流式細胞分析檢測這些表（biǎo）麵標誌物的相對熒（yíng）光強度變化，即可判斷化學物是否（fǒu）具備激活（huó）免疫係統的（de）潛（qián）能。

TG 497通過（guò）整（zhěng）合上述三種機製互補的體外方法，從生物學不同層麵綜合評估皮膚致敏性。隻要任（rèn）意兩項測試結果一致，即可做出科學、可靠的致敏性判斷，從而實現在此毒理終點上對動（dòng）物實驗的完全替代。這三（sān）項（xiàng）方法各自針（zhēn）對皮膚致敏有害結局通路中的不同關鍵節點，組合（hé）使（shǐ）用時增強了判斷的（de）穩健性和預測一致性。

TG 497被正式寫入OECD指南前，其（qí）開發團隊以及歐盟替代方法驗證中（zhōng）心、美國替代方法驗證協調委員會和（hé）日本替代方法驗證中心都（dōu）對其評估能力進行了驗證（zhèng），並與傳統動物實驗方法如局部淋巴結試驗（yàn）做了對比，結果顯示TG 497在多個核心指標上全麵優於局部淋巴結試驗。具體表現為：在敏感性上，TG 497達到了87%，相比（bǐ）之下局部淋巴結試驗為72%，證（zhèng）明前者在識別真正致敏物方麵表現更優；在特異（yì）性方（fāng）麵，TG 497為88%，也明顯高於（yú）局部淋巴結試驗的（de）75%，證明其在排除非致敏（mǐn）物時誤判更少；在準確率上，TG 497為87.5%，也高於局部淋巴（bā）結試驗的73%，證明其在（zài）整體預測效（xiào）能上表現更加（jiā）平衡；更為關鍵的是，與人體不良反應數據的一致性上TG 497達到了“非常高”，而（ér）局部淋（lín）巴結試驗僅為“中等（děng）偏高”，這表明TG 497在臨床相關性上更具優勢。

綜上所述，TG 497不僅在科（kē）學性能上（shàng）更為出色，而且由於其不依賴動物（wù）實驗、與人體數據一致（zhì）性更高，因此得以成為目前首個被國際（jì）監管機構OECD采納的完全替代皮膚致敏性動物試驗的標準體外測試方案。這一（yī）指南的頒布也標誌著毒理學替代方法從“輔助（zhù）”邁入“決策級”應用的關鍵進展。

盡管（guǎn）TG 497的成功被（bèi）視為替代毒理學領域的（de）重要（yào）裏（lǐ）程碑，但其（qí）背後反映出的研發過程也暴露了動物替（tì）代方（fāng）法開發的（de）諸多難點與局限。之所以能取得突破，首先因為皮膚致敏反應是（shì）目前有害結局通路建（jiàn）立最完善的毒理路徑之一，機製簡（jiǎn）單、事件明確（què）、模擬容易。相比（bǐ）之下，神經（jīng）毒性、免疫毒性、內分泌幹擾（rǎo）等終點（diǎn）路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現完（wán）全替代的體外（wài）組合方法。其次，TG 497研發成功的核心優勢（shì）還在於擁有有大量來自因斑貼測試、臨床案例和職業暴露的人體皮膚致（zhì）敏不良反應數據可用於（yú）方法驗證。而多數（shù）其它毒理領域仍嚴（yán）重依賴於動物實驗數據，缺乏可比對（duì）的人體資料，從而限製了相應（yīng）替代方案的（de）實際驗證路徑。即便（biàn）如此，TG 497成功（gōng）進（jìn）入OECD指南也（yě）曆經了漫長的驗證、標準化與（yǔ）互認過程。三（sān）項（xiàng）子（zǐ）方（fāng）法最早提（tí）出可追溯（sù）至2006年前後，但直至（zhì）2015年才以單獨測試（shì）方（fāng）法形式被 OECD 采納，2021年方整合為 TG497——整個流程耗時逾10年。

此（cǐ）外TG 497在（zài）皮（pí）膚致敏（mǐn）評估中仍存在化學品適用（yòng）範圍的盲區：它僅適（shì）用於小分子化學品，對金屬離（lí）子、複雜混合物（wù）、親水性或高反應性物質尚不適用；同時，也不適用於易幹擾測試係統穩定性的強刺激性或腐蝕性化合物。

可以說，TG497 的誕生既是（shì）一道分水嶺，也是一麵鏡子：一（yī）方麵，它首次證明“綜合（hé）測試方（fāng）案”完全（quán）可以獲（huò）得監管層麵的認可，為 OECD 體係內（nèi）其他毒（dú）理終點開發類似方法樹立了範式；另（lìng）一方麵，它警示我們，唯有深入掌握生物機製、係統整合多源數據並實現方法標準化與多中心（xīn）驗證，替代策略方能真（zhēn）正（zhèng）落地。更進一步（bù），TG497 的成功表明，替代路徑更適用於機製清晰、易於體外模擬且人（rén）體數據相對充足的毒理終點。總之，替代並非簡化，不（bú）是單憑熱（rè）情就可以“一（yī）蹴而就”的，而是在更高科學規範要求下，通過持續演化（huà）與完善才能夠得以實現；同時，其研發仍離不（bú）開動物實驗與人體反應數據（jù）的對照與支撐。因此，盡管TG497 為全麵替代動物實驗開了一個（gè）好頭，但在所有（yǒu）領域都實現（xiàn）這一目（mù）標仍有漫長的科學探索與製度建設之路要走。