滴眼給藥毒性試驗的目的

滴（dī）眼給藥毒性（xìng）試驗（yàn）是重複給藥一般（bān）毒性試驗，主要（yào）用於研發滴（dī）眼藥（yào）物。歐盟發（fā）布的《醫療用品非（fēi）臨床局部耐受性試（shì）驗（yàn）指導原則》（CPMP/SWP, 2001）明確規定了單次給藥和（hé）重複給藥（yào）眼部耐（nài）受性試（shì）驗的相關事宜。美國食品藥品監督管理局發布的《藥品以（yǐ）及可替代性給藥藥品非臨床安全性評價指導原則草（cǎo）案》（FDA/CDER, 2008）則明確要求（qiú）在滴眼給藥時應開展（zhǎn）係（xì）統藥代動力學（PK）和眼科檢查（包括裂隙燈顯（xiǎn）微（wēi）鏡檢查、眼底檢查、眼壓測量及組織病理學檢（jiǎn）查）。然而，這兩份指導原則中的相關規定均較簡要，缺乏滴眼給藥毒性（xìng）試驗詳細設計的具體內容。目前，尚無滴（dī）眼給藥毒性試驗的確切定義。日本（衛生福利部，1999）依據ICH M3指導原則（ICH, 2009）和ICH S4指導原則開展滴眼（yǎn）給藥（yào）毒（dú）性試驗。這些原則通常適用於係統給藥的藥（yào）物。

有人常常將滴眼給藥毒性（xìng）試驗與眼（yǎn）刺（cì）激試驗混為一談。實際（jì）上，滴眼毒性預試驗、一周或兩周（zhōu）的重複給藥滴眼毒性試驗的（de）方（fāng）案與眼刺激（jī）試（shì）驗的方案有相似之（zhī）處（OECD, 2012）。

目（mù）前（qián），眼刺激試驗通常使用兔子進行，以評估（gū）化學物質在粘膜給（gěi）藥或人體偶然接觸時的安全性（OECD, 2012）。眼刺激試驗的主要目的（de）是檢測眼表的刺激或腐蝕反應。

相比之下，滴眼給藥毒（dú）性試驗的主要目的是（shì）評估眼科（kē）藥物的一般毒性。因此，滴眼給藥毒性試驗的檢查項目包括組織（zhī）病理學檢查、眼部附屬器以及全身髒器的評價。這兩種試驗（yàn）的（de）差異見表1。

表1 滴眼給藥毒性試驗和眼刺激試驗的差異

滴眼給藥毒性試驗的設計

01、動物物種

根據ICH M3指導原則，一（yī）般毒性試驗需選擇（zé）兩種動物（wù）（ICH, 2009）。通常情況下，會從齧齒類動物（wù）（如兔或小鼠）和非齧齒類動物（犬或猴）中各選一種。然而，在過去十年間（2005~2016），經日本衛生勞動福利（lì）部（MHLW）批準，約九成（chéng）的滴（dī）眼液在研發過程中，將兔作為開展滴眼給藥毒（dú）性（xìng）試驗的首選實驗物種，其（qí）次常用的實驗物種是猴（幾乎全部是食蟹猴（hóu）），再然後是犬（見表（biǎo）2）。因此，滴眼給藥毒性試驗通常選擇（zé）兩種非齧（niè）齒類動物。不過，動物（wù）物種的選擇是根據具體情況而定的。因此，在評估某些藥物時，可能（néng）僅使用一個物（wù）種（比如兔或食蟹猴）。

表2 2005~2016日本滴（dī）眼液滴眼（yǎn）給藥毒（dú）性試驗的獲批的動物物種 

注：信息來源於日本醫（yī）藥和醫療器械（xiè）局（PMDA）主頁

近來發表的多篇文章從眼部安全（quán）性評估的角度出發，討論了各個實驗（yàn）物種的特點，並對不同實驗物種作了比較。各物種（zhǒng）的特點（diǎn）如下。

兔

兔的眼球重量約為人眼的一半，眨眼頻率（lǜ）（每6分鍾一次）明顯低於人類的眨眼頻率（每5秒鍾（zhōng）一次）。此外，兔的角膜比人類的角膜薄。基（jī）於這些特點（diǎn），並（bìng）考慮到影響藥物角膜滲透能力的因素，有研究者（zhě）預計，在滴入滴眼液後，兔眼的藥物暴（bào）露水平相對較高。McDonald和Shadduck（1977）認為（wéi）兔相較於其他實驗動物對眼刺激物（wù）更為敏感。使用（yòng）兔進行試驗的其他（tā）原因還包括較低的動物成本以及基於大（dà）量供試品（pǐn）積累的曆史（shǐ）數據。

在進行滴眼給藥毒性試驗時，特別需注意（yì）選擇色素兔還是白化（huà）兔。由於供試品能（néng）夠與（yǔ）色素（sù）兔體內的色素（sù）結合，因此在毒性評估時，色素兔更具優勢。關於色素兔，荷蘭帶兔比新西蘭大白兔和新西蘭紅兔（F1代兔）更常用於滴眼給藥毒性試驗。Durairaj等人（2012）報告稱，人、食蟹猴、犬、豬、F1代兔和荷蘭帶兔的（de）眼部黑色素含量（liàng）存在差異，而且不同物（wù）種之間眼（yǎn）睛各部分的（de）黑色素含量也不同。另外，值得一（yī）提的是，荷蘭帶兔的眼球比新西蘭大白兔或日本白兔的小。

猴

盡管食蟹猴的眼球重量僅約為人（rén）眼的一半，但其解剖特征與人類相似。例如，食蟹猴的角膜和（hé）晶狀體相對（duì）較（jiào）小，眼底有黃斑（bān）。Shibuya等人（2015）建議（yì）將食（shí）蟹猴（hóu）用作實驗動物，因為它們的眼睛（jīng）有助於詳細評估藥物誘導的黃（huáng）斑病變毒性。食蟹猴的眨眼頻率與（yǔ）人類相似。與人類一（yī）樣，食蟹猴既沒有（yǒu）瞬膜，也沒有哈氏腺，而兔、犬和豬則（zé）都有瞬膜和（hé）哈氏腺。食蟹猴和犬（quǎn）一樣，也用於係統毒性試驗。利用相（xiàng）關物種可以獲得毒理學數據，彌合局部給藥和係統給藥在同一物種（zhǒng）中產生的結果差異。與人類相比，食蟹猴的（de）眼組織黑色素含量相對較高。在猴類中，視神經（jīng）退化常（cháng）見於恒河猴和食蟹猴，且被認為是自發性先天（tiān）視神經病變。

犬和豬

針對（duì）特（tè）定目的飼（sì）養的比格（gé）犬的眼球重量約為5.5克，約為人眼重量的0.8倍，而豬的眼球大小接近人眼。從眼球（qiú）的絕對尺寸來看，犬和豬在藥物局部效應評估方（fāng）麵具有優勢，因為眼組織的（de）厚度和長度（dù）是決定局部給藥藥物滲透性和（hé）分布的重要因素。犬和（hé）豬的眼部解剖特征相似，例如，與靈長類動物（wù）相比，它們的晶狀體在眼球（qiú）中占據的體積相（xiàng）對（duì）較大。另一方麵，犬的脈絡膜上有毯氈層，而豬（zhū）、兔（tù）或食蟹猴則沒（méi）有。目前，犬和豬不常用於滴眼給藥毒（dú）性試驗，尤其是豬。然而，這類動物（wù）在滴眼給藥毒性試驗中仍有其獨特的優勢，理由如下：1. 基於上述解（jiě）剖和生理特點，模仿人體藥物分布的可能性較（jiào）高。2. 與兔和食蟹（xiè）猴相比，由於犬和（hé）豬的體型相對較大，通過係統給藥出現的藥物反應更少（shǎo）。

02、性別

根據一般毒性試驗指導原則（衛生福利部，1999），滴眼給藥毒性試驗應在兩種性別的動物上進行。人類、恒河猴和兔的眼（yǎn）軸長度存在性別差異，但眼球尺寸（cùn）的性別（bié）差異（yì）卻極其（qí）微小。Wagner等人（2008）研究了健康人眼和患病（bìng）人眼的性別（bié）差異，認為性激素影響了不同性別在患病狀態下的淚腺係統、眼瞼和眨眼頻率、以及角膜的解剖和特征。一般而言，幹眼流（liú）行病學研（yán）究表明女（nǚ）性幹眼發病率比男性高。然而，實驗動物的眼睛是（shì）否存在顯著的性別差異尚不明確。是否在滴眼給藥毒性試（shì）驗中使用兩種性別，尤其僅進行眼毒性評估的試驗（yàn），仍有待（dài）進一步討論。

03、給藥

劑量和濃度（dù）

根據ICH M3指導原則（ICH，2009），一般毒性試驗的（de）高劑量水平設定為最（zuì）大耐受量（MTD）、最大給藥量（MFD）或人體（tǐ）暴露量的50倍。這一設定原則同（tóng）樣適用於滴眼給藥（yào）毒性試驗（yàn）。在某（mǒu）些情況下，高劑量水平可以基於局部耐受性預試驗的結果來（lái）確定。然而，在大多數情況下，滴眼給藥毒性試驗的高劑量水平是根據MFD設定的，主要是由於製劑製備的（de）某些內在因素。

供（gòng）試品的（de）角膜（mó）滲透性主要取決於製劑的特性。為了獲得有意義的風險評估結果，權威性滴眼給藥（yào）毒性試（shì）驗（例如（rú）首次人（rén）體試驗之前開展的GLP試驗）所用的供試製劑應與臨床試驗所（suǒ）用的製劑一致或相近。供試品的濃度（dù）主要（yào）是根據其在製劑中（zhōng）的溶解度來定義的。至於製劑的調整，其他（tā）特（tè）性（xìng）（如滲透壓、pH值和賦形劑）也十分重要。滴（dī）眼液製劑的酸堿度應在可接受（shòu）的生理範圍內（nèi）。選擇（zé）防腐劑時，需避免其濃度達到引起毒性反應的水平。例如，有研究者發現，眼科製（zhì）劑中常用（yòng）的防腐劑苯紮氯（lǜ）銨在局部給藥時會誘發角膜變化。因此（cǐ），眼科製劑中防腐劑的濃度是有限製的。因此，在（zài）大多數情況下，滴眼（yǎn）給（gěi）藥毒性試（shì）驗所設的最高劑量水平（píng）是（shì）基於受試製劑的（de）最大給藥量，而非供（gòng）試品本（běn）身的特性來決定的。

滴眼體積

兔子的眼瞼較為鬆弛，結膜囊較（jiào）大，因（yīn）此能容納較大（dà）的滴眼（yǎn）液體積。根（gēn）據OECD眼刺激試驗指導原則，兔子的滴眼體積為0.1 mL（OECD, 2012）。該（gāi）體積約為臨床標準滴眼液用藥體積（約0.04 mL）的兩倍。從經驗來看，不同物（wù）種的最大滴眼（yǎn）體積並不相同。例如，比格（gé）犬和兔子的最大（dà）可行體（tǐ）積相似，而食蟹猴的最大可行體積（jī）則是比格犬和兔子的兩倍多。

需注意（yì）的是，眼部暴露量並（bìng）不會隨著滴眼體積的增加而成比例增加，因（yīn）為部分多餘的液體（tǐ）會通過鼻淚管（guǎn）流失。Lambert等（1993）假定在眼刺激試驗中（zhōng），如果滴眼（yǎn）體積為0.01 mL（建議供試體積的十分之一），藥物與人眼刺激感受的相關性更佳（jiā）。因此（cǐ），滴眼給藥毒性試驗的滴眼體積可能需進一步討論。增（zēng）加滴眼體積並不能有效提高（gāo）眼部暴露量，反而可能導致係統暴（bào）露量增加，甚至（zhì）引發意料之外的係統毒性反應。

單眼/雙（shuāng）眼給（gěi）藥

供試品是單眼給藥還是雙眼給藥需慎重考慮。從動物福利的角度出發，若無特殊原因，應將（jiāng）供試品滴（dī）入單側眼睛。如一隻眼給予供試品，另一隻眼則不給藥（即不接觸供試品），或給予對照品（例如溶媒製（zhì）劑）作為對照。然而，嚴格來說，對照眼由於係統循環的影響，可能也會接觸到供試品（pǐn）。因此，在評估對照眼（yǎn）的結果時，應該考慮到這一潛在的接觸（chù）因素。

給藥頻率

在標準的口服或靜脈給藥一般毒性試驗中，通常每天給藥一（yī）次；而在滴眼給藥（yào）毒性試驗中，通常一天給藥（yào）多（duō）次。非（fēi）臨床試驗的滴眼頻率通常高於（yú）臨床試驗的給（gěi）藥頻率。例如，非臨床試驗中可（kě）能（néng）每天滴眼（yǎn）4次，而臨床試驗中（zhōng）則每天滴眼2次（cì）。滴眼給藥毒性試驗設（shè）定較高的給藥頻率，旨在獲得更高的（de）重複暴露量，特別是在供試品的生（shēng）化特征（zhēng）導致（zhì）最大藥物濃度難以增（zēng）加時更為重要。Chrai等人（1974）報告稱，如果兩次（cì）滴眼間隔5分鍾，就能有效地增加兔的（de）眼部暴露量。許多滴眼給藥毒性試驗的給藥頻率（lǜ）是臨床給藥頻率（lǜ）的（de）1.5到2倍（bèi）。然而，給藥過於頻繁雖可提高暴露水平，但也增加（jiā）操作的次數，從而增加動物保定的頻率，這可能導致動物應激，進（jìn）而引發倫理（lǐ）問題。因此，在設計滴眼給藥（yào）毒性試驗時，需（xū）在提高暴（bào）露水平和減少動（dòng）物應激（jī）之間找到平衡點，以確保試驗的科學（xué）性和倫理（lǐ）性。

04、眼及附屬組織檢查

常規（guī）/標準眼科學檢查

滴眼給藥毒性試驗目前尚無統一（yī）的眼部和係統檢查項目。OITSs的眼科學檢查（chá）是基於係統藥物一般毒性評估指導原則進行的，涵蓋了眼前節、眼（yǎn）內介質和眼底等所（suǒ）有組織的檢查（ICH, 1999）。然而，由於滴眼給藥直接（jiē）作用於眼部，滴（dī）眼給藥毒性試驗（yàn）的眼科學檢查更加詳細，涵蓋的（de）檢查項（xiàng）目也更多。Weir和Wilson（2013）列出（chū）了非臨床眼毒性試驗的標準眼部安全性終點，這些終點具有重要的借鑒意義。檢查（chá）項目包括：大體觀（guān）察、裂隙燈生物顯微鏡檢查、眼底檢眼鏡檢查（chá）、眼壓測量、視網膜電圖和組（zǔ）織病理學。

基於相關指導原則和知識，表3總結了滴眼給藥毒性試驗的常規及可選眼科檢查項目。由於眼前節的供試品濃度（dù）較高，因此對眼前節進行觀（guān）察和（hé）檢查尤為（wéi）重要。除標準的大體觀察外，采用評分方（fāng）法進行詳（xiáng）細觀察（chá）對於評估眼毒性的嚴重程度非常關鍵（jiàn）。例如，Draize評分法用於角膜、虹膜和結膜的大體觀察。McDonald Schadduck評分和Hackett-McDonald評分常應用於滴眼給（gěi）藥毒性試驗中，二者對裂隙燈顯（xiǎn）微鏡檢查結果進行評分。特別是，Hackett-McDonald評分（fèn）能對（duì）眼睛進（jìn）行全麵（miàn）評估，包括對晶體和（hé）瞳孔光反射的評估。

表3 滴眼給藥毒性試驗的常規或可選眼科學檢查

常規檢（jiǎn）查包括利用檢眼鏡對玻璃體和眼底進行觀察。使（shǐ）用直（zhí）接檢眼（yǎn）鏡和間接檢眼鏡可詳細檢查眼底。本原（yuán）則建議，除拍照外，還應簡述檢查結（jié）果並記錄（lù），並將這些記錄與相應的詳細記錄一同保存。

眼壓是（shì）衡量前房角功能變化的重要參數。FDA指導原則提到了使用眼壓計的方法（FDA/CDER，2008）。在非（fēi）臨床毒性試驗中，常（cháng）用扁（biǎn）平眼壓計、回彈式眼壓計（jì）或空氣式眼壓計來測量（liàng）眼（yǎn）壓。在滴眼給藥毒性試驗中，使（shǐ）用眼壓計（jì）有幾點注意事項（xiàng）。首先，為了獲得準（zhǔn）確的眼壓值，有必要使動物適應眼壓計。在測量之前，如果動物沒有適應眼壓計，通常情況下測出的眼壓值會偏高，從而導致無法（fǎ）正確判斷藥效。其次，由於儀器會接觸角膜（mó）表麵，眼壓測量操作可能會在某種程度上損傷角膜上皮細胞。因此，應慎重決定檢查的組別及檢查順序，以避免眼部過度應激，並防止過度應激影響其他結果的解讀。

通（tōng）過全視野視網膜電圖檢查（ffERG）可檢測視網膜的功能變化。理想的做法是使用國際臨床視覺電（diàn）生（shēng）理協會（huì）（ISCEV）建議的方（fāng）法，因為此方法可在進行全視野視網膜電圖檢查時識別視錐細胞和視杆細胞的變化。然而，此方法不適用於（yú）在有限時間內對大量動物進行（háng）檢查的情況。ISCEV方法擬用於隨（suí）診檢查，可能僅適用於ERG檢查（chá）發現異（yì）常的情況。例如，Penha等人（2010）報（bào）告稱，角膜混濁或晶（jīng）體混（hún）濁會影響光（guāng）線到達（dá）視網膜，而麻醉也會影響全視野視網膜電圖的檢查結果。

可選檢（jiǎn）查

關於淚膜檢查，Schirmer試驗和酚紅線試驗用（yòng）於淚液體積的（de）定量（liàng）分（fèn）析（xī）。進（jìn）行Schirmer試驗和酚紅線試驗時，分別使用無毒濾紙或棉線浸潤於pH指示劑酚紅溶液中，然後（hòu）插入結（jié）膜（mó）囊內進行淚膜檢測。淚膜的其他臨床檢查包括淚膜破裂時間。此前已有研究者報告（gào）了犬和兔的淚膜破裂時間，這些測試能夠揭示淚腺的功能狀態。此外（wài），眨眼頻率也可以間接說明供試品是否對角膜產生了刺激。

由於眼科成像（xiàng）技（jì）術的進步，現在能檢測出常規眼科（kē）學檢（jiǎn）查（chá）難以察覺的變化。例如，角膜共焦顯微鏡檢查（chá）能夠捕捉（zhuō）到角膜上皮的細微變化；角膜內皮（pí）顯微鏡檢查能夠觀察到角膜內皮的形態和密度變化；光（guāng）學相幹斷層掃（sǎo）描（OCT）對於視網膜的觀（guān）察非常有（yǒu）力。這些成像（xiàng）技術均可用（yòng）於滴眼給藥（yào）毒性試驗中的動物檢查，能夠生成（chéng）高分辨率的圖像，滿（mǎn）足（zú）組織病理學檢查的要求。

滴眼給藥毒性試驗的其他常用眼（yǎn）前節檢查包括定量測量角膜厚度（dù）的（de）測厚（hòu）儀和定量測量前房房水閃輝的（de）激光房（fáng）水閃光細胞儀。如果眼後節的視網膜出現局部異常，多焦視（shì）網膜電圖（mfERG）能夠捕（bǔ）捉到相應的電生理信號。利用眼底血管熒光造影能夠觀察到視網膜和（hé）脈絡膜的原有血管及新生血管的滲透性。

Kontadakis等人（2014）指出，淚膜中的細胞因子和生長因子作為生物標記（jì）物，能預示眼表疾病（bìng）。有研究者報告稱，血清細胞因子是預示老年黃斑（bān）變性的生（shēng）物標記物（wù）。生物標記物能用於非侵（qīn）入性方（fāng）式觀察藥物誘導的眼毒性反應。然（rán）而，目前這樣的生物標記物數量仍然有限。反過來，上述的各（gè）種眼部（bù）成像技術可能可替代（dài）生物標記物，用於觀察和研究人和動物的眼毒性。

05、眼及附屬組織的病理學檢查

組織病理檢查是滴眼給藥毒性試驗的重（chóng）要組成部分。最近，多篇文獻綜述一致強調了組（zǔ）織病理學檢查在藥物評（píng）估中的重要性。在滴眼給藥（yào）毒性試驗中，供試品的最（zuì）大暴（bào）露量不僅出現在角膜上皮，還出現在結膜和排泄係（xì）統，包括鼻淚管的粘膜和鼻腔。因此，需要特別注意細致檢查這些組（zǔ）織。淚腺、哈氏腺（若有）、鼻腔和瞬膜（若有）也應進行組織病理學（xué）檢查。為了準確地進行組織病理學評估分析，必須（xū）嚴格考量組（zǔ）織病理切片（piàn）的質量。如（rú）今已有多篇關於（yú）這一方麵的文章發表，詳細闡述了切片的各種技術考量。